酶工程基础概念
酶的定义与特点
- 定义：酶是由活细胞产生的具有催化功能的生物大分子（多数为蛋白质，少数为RNA）。
- 特点：
- 高效性（降低反应活化能）
- 专一性（底物特异性、反应特异性）
- 温和条件（常温、常压、中性pH）
- 可调控性（受抑制剂、激活剂影响）
酶的分类与命名
- 国际分类（EC编号）：
- 氧化还原酶（EC1）：催化电子转移（如脱氢酶、氧化酶）。
- 转移酶（EC2）：转移功能基团（如转氨酶）。
- 水解酶（EC3）：水解反应（如蛋白酶、脂肪酶）。
- 裂解酶（EC4）：非水解性键断裂（如脱羧酶）。
- 异构酶（EC5）：分子内重排（如变位酶）。
- 连接酶（EC6）：ATP依赖的合成反应（如DNA连接酶）。
酶的分离纯化技术
粗提方法
- 细胞破碎：
- 机械法（超声、高压匀浆）
- 化学法（表面活性剂）
- 酶解法（溶菌酶）
- 初步分离：
- 盐析（硫酸铵沉淀）
- 有机溶剂沉淀（丙酮、乙醇）
精细纯化
- 层析技术：
- 离子交换层析（按电荷分离）
- 凝胶过滤层析（按分子大小）
- 亲和层析（特异性结合，如His标签纯化）
- 电泳技术：SDS-PAGE（检测纯度与分子量）
酶的固定化技术
固定化方法
- 吸附法：物理吸附于载体（如硅胶、活性炭），操作简单但易脱落。
- 共价结合法：酶与载体形成共价键（如戊二醛交联），稳定性高但可能失活。
- 包埋法：酶包裹于凝胶（如海藻酸钠、聚丙烯酰胺），适合大规模应用。
- 交联法：酶分子间通过双功能试剂（如戊二醛）连接，形成网状结构。
固定化酶的优缺点
- 优点：可重复使用、易分离、稳定性提高。
- 缺点：活性可能降低、成本较高。
酶的分子改造
理性设计
- 定点突变：通过PCR引入特定突变（如提高热稳定性）。
- 同源建模：基于已知结构预测酶的功能位点。
非理性设计
- 定向进化：随机突变+高通量筛选（如易错PCR、DNA shuffling）。
半理性设计
- 结合计算机模拟与实验验证（如Rosetta软件）。
酶的应用
工业领域
- 食品工业：淀粉酶（酿酒）、蛋白酶（奶酪制作）。
- 洗涤剂：碱性蛋白酶（去污）。
- 纺织业：纤维素酶（牛仔布做旧）。
医药领域
- 诊断：葡萄糖氧化酶（血糖检测）。
- 治疗：溶栓酶（如尿激酶）。
环保领域
- 废水处理：漆酶降解酚类污染物。
考试常见题型与答题技巧
- 名词解释：如“米氏常数（Km）”“固定化酶”。
- 简答题：比较不同固定化方法的优缺点。
- 计算题：酶动力学（如Lineweaver-Burk作图）。
- 论述题：酶工程在生物制药中的应用。
答题技巧：
- 结合实例（如定向进化在工业酶改良中的应用）。
- 图表辅助（如绘制酶促反应曲线）。
参考文献
- 张树政. 《酶工程》. 化学工业出版社.
- 邹承鲁. 《酶学》. 科学出版社.
- Nelson D.L., Cox M.M. 《Lehninger Principles of Biochemistry》.
提示：考试前重点复习酶的分类、固定化技术和应用实例，结合实验操作理解纯化步骤。
